조류인플루엔자 인체감염증 바이러스

개 요

1. 병원체 특성

조류인플루엔자의 원인체는 Orthomyxoviridae에 속하는 단일 나선의 RNA 바이러스인 인플루엔자 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 겨울철 급성 상기도 감염을 주로 일으키며 38℃ 이상의 고열과 인후통 및 근육통을 특징으로 하는 병원체이다. 비리온의 형태는 대개 구형에 가까우며 크기는 지름이 200 ㎚ 정도이다. 분절된 유전자로 이루어진 인플루엔자 바이러스는 Matrix (M)와 Nucleoprotein (N) 항원에 의해 A, B, C의 3가지 형 (type)으로 구분된다. 그 중 사람뿐만 아니라 돼지, 말 등의 포유류 및 조류와 같은 다양한 숙주에 감염되어 질병을 일으키는 A형 바이러스는 주요 항원인 Hemagglutinin (H)과 Neuraminidase (N)에 의해 아형 (subtype)이 구분되는데, H 혈청형이 16가지, N 혈청형이 9가지가 존재하므로 산술적으로 가능한 A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 144가지이다. 야생 조류는 이 모든 종류의 혈청형을 다 보유하고 있는 것으로 알려져 있으며 그 중 H1N1 및 H3N2형이 주로 인간에게 감염되어 유행을 일으켰으나 최근, 조류에만 발생하던 H5N1, H7N7, H9N2 등의 바이러스가 사람에게 감염을 일으켜 전 세계적으로 큰 문제가 되고 있다.

조류인플루엔자 바이러스의 병원성은 국제수역사무국 (Organisation Mondiale de la Sante Animale, OIE)이 정한 규정에 따라 비병원성 (Non pathogenic), 저병원성 (Low pathogenic), 고병원성 (Highly pathogenic)으로 분류한다. 고병원성 조류인플루엔자 (Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI)의 정의는 4∼8주령의 SPF (specific pathogen free) 닭에 바이러스를 정맥으로 접종하여 10일 이내에 75%의 폐사를 보이거나, 12.5% 이상 62.5% 이하의 닭이 폐사하였으나 혈청형이 H5나 H7이 아닐 경우에는 세포에 접종하여 세포병변 (cytopathic effect, CPE)을 보이면 HPAI로 분류하며, 혈청형이 H5 혹은 H7일 경우에는 세포에 접종 후 세포병변을 보이고 H 항원의 분절부위 (cleavage site)의 아미노산 배열이 RRKKR/GLFG, Arg-Arg-Lys-Lys-Arg/Gly-Leu-Phe-Gly 배열의 고병원성 인플루엔자 바이러스의 특징을 보일 경우 HPAI로 분류한다.

그림 1. 인플루엔자 바이러스 전자현미경 사진 (Linda M. Stannard, University of Cape Town)

2. 임상증상

조류인플루엔자에 의한 인체 감염은 1997년 홍콩에서 A/H5N1형에 의해 18명이 감염되어 그 중 6명이 사망한 이후 최근에는 A/H5N1형에 의한 인체 감염 사례가 동남아시아 국가와 중국 및 중동, 아프리카 지역으로도 확산되고 있으며, 2006년 11월 29일 현재까지 10개국에서 258명의 환자가 발생하여 158명이 사망하였다.

조류인플루엔자로 인한 인체 감염의 경우 무증상, 경한 호흡기 증상, 심한 폐렴, 다기관 부전 등으로 다양한 양상을 보이는데, 초기 증상도 발열, 두통, 전신쇠약, 근육통, 인후통, 기침, 콧물 등이고 일부에서는 결막염, 위장관 증상으로 다양하게 나타난다. 조류인플루엔자는 크게 3단계 임상양상을 보이는데, 1단계는 무증상 또는 경증 호흡기 증상, 발열 등이고, 2단계에서는 심한 폐렴, 혈액학적 신장 및 간 기능 이상소견을 보이며, 3단계에서는 급성호흡부전증, 다기관 부전소견을 보이며 사망하게 된다.

3. 역학

사람 인플루엔자는 감염성 비말 및 비말핵의 흡입, 직접적 접촉, 그리고 상부 호흡기 또는 결막 점막에서의 자가 접종과 같은 간접 접촉에 의하여 전파된다. 조류인플루엔자 인체 감염에 있어서 현재까지 조류 대 사람 전파, 환경 대 사람 전파의 가능성 그리고 제한적이고 지속되지 않는 사람 대 사람 전파의 증거가 있다.

WHO는 조류 인플루엔자 바이러스가 유전자 변이를 일으킬 경우 “사람 간 감염이 시작되어 인플루엔자 대유행”으로 진전될 가능성을 경고하고 있으며, 1918년 스페인 대유행 예로 볼 때 약 1천만 명의 환자가 발생하고, 1백만 명이 입원하며, 10만 명이 사망할 것으로 추정되는 등 막대한 인명 피해는 물론 심각한 사회 경제적 위기를 초래할 우려가 있음을 경고하고 있다.

예방 및 관리

1. 예방

조류인플루엔자를 예방할 수 있는 가장 최선의 방법은 백신 접종이다. 그러나 백신을 제조하기 위해서는 인체 감염을 일으키는 바이러스를 분리하여 백신을 만들 수 있는 종자 바이러스로 만들어 백신 제조회사로 공급하여야 하는데, 이에 걸리는 시간이 4개월 이상 소요된다. 따라서 그 기간 동안 대처할 수 있는 방법이 예방적 차원의 항바이러스제 투여이다.

2. 치료 / 백신

인플루엔자 치료제로 사용되는 항바이러스제가 조류인플루엔자 치료에도 사용되고 있으나, 최근 분리되는 조류 인플루엔자 바이러스는 M2 억제제인 amantadine이나 rimantadine에 내성을 나타내어 치료제로 사용할 수 없는 경우가 있으며, 뉴라미니다제 억제제 (zanamivir, oseltamivir)는 효과가 있으나 발병 후 48시간 내에 복용해야만 치료 효과가 있다.

현재 상업적으로 시판중인 사람에 대한 인플루엔자 A/H5 백신은 없다. 초기 H5 백신은 면역원성이 약하였으며, 고농도의 H 항원 용량의 2회 접종이 필요하거나 중화항체반응을 유도하기 위해 MF59 항원 보강제 (adjuvant)를 첨가하는 것이 필요할 것이다. 최근 인플루엔자 A/H5N1 분리주로부터 무병독성 백신 바이러스 주를 신속하게 생산하기 위해 역유전학 (reverse genetics)이 사용되어 왔으며, 몇 가지 후보 백신들이 연구 중에 있다. Alum과 같이 인증된 항원 보강제를 이용한 연구가 필요하며, 생약독화, 한랭적응 (cold-adapted) 비강 내 백신 또한 개발 중이다.

실험실 진단

진단기준

▸검체 (인후도찰물, 인후흡입물 등)에서 H5N1 바이러스 분리

▸검체에서 바이러스 유전자 검출

▸회복기 혈청의 중화 항체가가 급성기에 비하여 4배 이상 증가

▸단일 혈청에서 중화 항체가가 1:80이상이며, 다른 혈청검사 결과 양성

1. 검체

1) 검체 채취 및 운반 시 주의사항

가. 발생 농장에 대한 역학 조사 시 반드시 개인보호장비를 착용한다.

나. 인체 간 전파가 확인된 국외 조류 인플루엔자 유행지역에서 입국한 인플루엔자 의사환자 진찰 및 검역 시 반드시 개인보호장비를 착용하고 수행하며, 의사환자 검체를 운반할 때에는 개인보호장비를 착용한 상태에서 검체를 Biohazard 용기에 밀봉한 후 운반하도록 한다.

※ 개인보호장비 (D급) : 개인보호복, N-95 마스크, 장갑, 보안경, 보호덧신

2) 검체 채취

실험실 검사에 필요한 검체로는 호흡기 검체와 혈액이 있는데, 호흡기 검체에는 인후 도찰물, 비인후 흡입물 그리고 객담 등이 있다. 비인후 흡입물 및 객담은 무균용기에 채취하고, 인후 도찰물은 바이러스 수송배지 (virus transport medium, VTM)에 채취한 후 4℃를 유지하여 가급적 빠른 시간 내 검체를 실험기관으로 송부한다. 혈액은 plain tube에 5㎖ 정도 채취하며 1차 채혈 후 3주 후에 2차 채혈하여 질병관리본부 인플루엔자 바이러스팀에 의뢰한다.

2. H5N1 바이러스 분리

바이러스 분리 검사는 민감한 방법이며, 분리한 바이러스를 이용해 항원 및 유전적 특성 분석, 약제 감수성 검사, 백신 개발 등에 이용될 수 있는 장점이 있다. 인플루엔자 바이러스 배양에는 Madine-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포주가 주로 사용되며, 분리된 바이러스의 확인은 특이 단클론 항체를 이용한 간접면역형광법, 혈구응집법 및 혈구응집억제법 (haemagglutination inhibition, HI), 그리고 A/H5 특이 primer를 이용한 RT-PCR을 통해 가능하다.

인플루엔자 A/H5가 의심되는 임상 검체와 세포배양의 취급을 위해서는 표준생물안전지침을 따라야 한다. 특히 새로운 재조합 바이러스의 출현을 막기 위하여 사람에서 채취된 임상 검체와 돼지 및 기타 조류에서 채취된 검체와는 동일한 실험실에서 취급하여서는 절대로 안 된다.

3. 유전학적 검사

역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)은 인플루엔자 바이러스 유전자를 검출하는데 매우 강력한 방법이다. 인플루엔자 바이러스 유전자는 단일 가닥의 RNA로 이루어져 있으며 역전사효소 (reverse transcriptase (RT) polymerase)를 이용하여 cDNA를 합성하여야 한다. RNA를 증폭하는 과정 (RT-PCR)에 한 쌍의 oligonucleotide primer가 필요하다. 이들 primer 쌍은 알려진 인플루엔자 A/H5의 HA 유전자와 N1형의 NA 유전자의 염기서열에 근거하여 고안되었다. 아형 특이 primer로 만들어진 DNA는 염기서열 분석과 같은 분자 유전학적 기법에 의해 향후 분석이 가능하다. 아래에 나열된 primer는 WHO에서 권고하는 H5형 및 H9형 조류인플루엔자 진단을 위한 표준 primer이다.

표 1. 조류인플루엔자 진단을 위한 primer

Primer	염기서열 (5‘→3’)	산물크기 (bp)	표적부위
H5-1	GCC ATT CCA CAA CAT ACA CC	219	A/H5 HA
H5-3	CTC CCC TGC TCA TTG CTA T
N1-1	TTG CTT GGT CGG CAA GTG	616	N1
N1-2	CCA GTC CAC CCA TTT GGA TC
H9-426	GAA TCC AGA TCT TTC CAG A	383	A/H9 HA
H9-808R	CCA TAC CAT GGG GCA ATT A

(WHO, 2005)

먼저, 임상 검체로부터 RNA를 추출한 후 유전자를 증폭한다.

1) H5 또는 N1

다음과 같이 master mixture를 준비한 후 위에서 추출한 RNA 5㎕를 첨가한 후 RT-PCR을 실시한다.

□ Master mixture : 5X QIAGEN RT-PCR buffer 10㎕, dNTP mix 2㎕, 5X Q-solution 10㎕, forward primer (5uM) 6㎕, reverse primer (5uM) 6㎕, enzyme mix 2㎕, RNase inhibitor (20U/㎕) 0.5㎕, water (molecular grade) 9㎕ (total 45㎕)

2) H9

다음과 같이 master mixture를 준비한 후 위에서 추출한 RNA 5㎕를 첨가한 후 RT-PCR을 실시한다.

□ Master mixture : 5X QIAGEN RT-PCR buffer 10㎕, dNTP mix 2㎕, forward primer (5uM) 6㎕, reverse primer (5uM) 6㎕, enzyme mix 2㎕, RNase inhibitor (20U/㎕) 0.5㎕, water (molecular grade) 19㎕ (total 45㎕)

표 2. 반응조건

반응온도	반응시간	Cycle
50℃	30min	1
95℃	15min	1
94℃	30sec	35
55℃	30sec
72℃	30sec
72℃	2min	1
4℃	ever

유전자를 증폭한 후 1.5% 아가로스 겔에 전기영동 하여 증폭 산물을 확인한다.

그림 2. One-step RT-PCR에 의한 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검출. M: 100bp size marker, lane1: H5 (H5N1), lane2: N1 (H5N1), lane3: H9 (H9N2), lane 4～6: 음성대조

4. 혈청학적 진단

A형 인플루엔자 특이 항체를 확인하는데 이용 가능한 혈청학적 검사는 혈구응집 억제법 (haemagglutination inhibition, HI), 효소 면역법 (enzyme immunoassay) 그리고 바이러스 중화시험법 (virus neutralization test)이 있다. 마이크로 중화시험법 (microneutralization test)은 고병원성 조류인플루엔자 특이 항체 검출에 있어 WHO에서 권고하는 방법이며 감염성 바이러스를 이용하기 때문에 BSL 3 실험실이 갖추어진 곳에서만 수행이 가능하다.

마이크로 중화시험법을 이용한 조류인플루엔자 특이 항체 검출 방법은 다음과 같다. 먼저, 혈청을 불활화 (56℃, 30 min) 시킨 후 90 ㎕의 diluent (MEM, 1% Bovine serum albumin (BSA), 1% Antibiotic)가 분주된 96well plate의 첫 번째 well에 10 ㎕씩 넣는다. 첫 번째 well에서 50 ㎕씩 취해 다음 well로 2배 단계희석을 실시한 후 2X103 TCID50/㎖의 조류인플루엔자 바이러스 50 ㎕를 첨가한 후 1시간 동안 배양 (37℃/ 5% CO2) 한다. 이 때 각각의 plate에 바이러스 컨트롤과 세포 컨트롤을 포함한다. 1시간 배양 후 각 well에 1.5X103 cells/㎖ 의 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포를 100 ㎕씩 첨가한 다음 18-22시간 배양한다. 80% Acetone으로 고정시킨 후 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 3회 세척하고 1차 항체 (anti-influenza A NP mouse monoclonal Ab, 1:4,000)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨다. 4회 세척 후 2차 항체 (goat anti-mouse IgG conjugated with HRP, 1:2,000)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 발색을 위한 기질 (o-phenylenediamine dihydrochloride ; OPD)을 첨가한 다음 490nm의 파장에서 흡광도를 측정한다. Cut off 값을 결정한 후 그 결과 중화 항체가 1:80 이상의 경우 양성으로 판정한다.

5. 판정 및 보고

실험실 진단 결과 다음에 해당하는 경우 조류인플루엔자 양성으로 판정한다.

1) H5N1 바이러스 분리

2) 두 가지 서로 다른 PCR target (예, 인플루엔자 A와 H5 HA gene)을 이용한 H5 PCR 양성

3) 증상 발현 후 7일 이내 채취한 급성기 혈청과 회복기 혈청에 대한 H5N1 중화시험 결과 중화항체가의 4배 이상의 상승. 단, 회복기 혈청의 중화항체가는 1:80 이상이어야 함.

4) 증상발현 14일 이후에 채취한 단일 혈청에서 H5N1 중화 항체가가 1:80 이상이며 다른 혈청검사 양성 결과 (예, 말(馬) 혈구를 이용한 혈구응집억제시험 (Horse HI)항체가 1:160 이상 또는 H5 특이 웨스턴블롯 (Western blot, WB) 양성)

그림 3. 조류인플루엔자 바이러스 검사 체계도

참고문헌

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2. The writing committee of World Health Organization (WHO) on human influenza A/H5. Avian influenza A (H5N1) infection in humans. N Engl J Med, 353, 1374-85 (2005)

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4. WHO. WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. (2002) Geneva, World Health Organization (document WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5, available at: http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs/20025rev.pdf

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